Turbidimetria ako objektívny nástroj na odhalenie podvodu v kvalite mlieka
Oblasť skúmania
Mlieko je veľmi zložitou zmesou látok, bielkovín, tukov, cukrov, z ktorých významnú úlohu pre náš vývoj má mliečna bielkovina – kazeín. Kazeín sa vyskytuje len v mlieku cicavcov. Jeho obsah kolíše medzi 70 – 80 % z celkového počtu bielkovín. V sušine mlieka je ho asi 2,5 – 2,6 %. Vytvára zložité útvary – nachádza sa vo forme kazeínových miciel (koloidná fáza: 90 – 95 %) alebo v rozpustnej podobe (molekulárna fáza: 5 – 10 %). Micely sú útvary, ktoré vznikajú vo vodnej fáze mlieka v dôsledku prítomnosti tukových kvapôčok, ktoré sa neznášajú s vodou (sú hydrofóbne, po grécky je hydor „voda“ a fobein znamená „báť sa“) a nevedia sa v nej rozpustiť na pravý roztok. Micely v mlieku a ich agregáty vnímame ako biele zhluky, pretože majú väčšiu veľkosť (mikrometre; 10-6 metra), ako je vlnová dĺžka červeného svetla (cca 600 – 700 nm; 0,7 mikrometra), a odrážajú do našich očí všetky fotóny denného svetla (od 400 nm do 750 nm).
Keď si kupujeme kravské mlieko, podľa obsahu tuku si vyberáme nízkotučné, polotučné alebo plnotučné mlieko. Obsah tuku určuje, ako nám mlieko chutí. Na trhu máme rôznych výrobcov a distribútorov kravského mlieka. Ak sa chceme presvedčiť, či kúpené mlieko je kvalitné a či obsahuje uvádzané množstvo tukov, potrebujeme zistiť, ako je pôvodné kravské mlieko riedené vodou. Biela farba mlieka, ktorú vnímame, je závislá od koncentrácie miciel (t. j. od množstva bielkovín a tukov v mlieku). Čím je mlieko väčšmi riedené vodou, tým je koncentrácia miciel menšia.

Obr. 1 Komerčne dostupné nízkotučné, polotučné a plnotučné mlieko
Teoretická časť
Turbidimetria (názov odvodený od zákalu) je analytická metóda, ktorá je založená na meraní straty intenzity svetla prechádzajúceho cez meraný roztok (prepúšťaného svetla) v dôsledku rozptylového účinku častíc nachádzajúcich sa v roztoku (v mlieku). Svetlo prechádza cez filter (pri prístrojoch s LED zdrojom svetla ho netreba), čím vytvára svetlo so známou vlnovou dĺžkou, ktoré sa potom vedie cez kyvetu obsahujúcu roztok mlieka (kyveta sa vkladá do turbidimetra). Fotoelektrická bunka (fototranzistor, fotonásobič a podobne) zhromažďuje svetlo, ktoré prechádza kyvetou. Meranie udáva množstvo absorbovaného svetla v roztoku (v suspenzii mlieka). Čím viac častíc je obsiahnutých v meranej vzorke mlieka, tým viac svetla sa absorbuje prechodom cez kyvetu.

Obr. 2 Schematické znázornenie princípu turbidimetrie
Experimentálna časť
Ciele:
1. Zoznámiť sa princípmi stanovenia látok turbidimetriou.
2. Experimentálne zistiť kvalitu mlieka využitím turbidimetrie.
Úlohy
1. Kalibrovať turbidimeter podľa návodu na obsluhu.
2. Pripraviť vodné roztoky vzoriek mlieka podľa nasledujúceho postupu.
3. Odmerať hodnoty turbidity pre pripravené vzorky.
4. Vyhodnotiť výsledky merania a zostrojte kalibračnú závislosť.
5. Stanovte koncentráciu tuku mlieka v neznámej vzorke.
Postup
1. Kalibráciu turbidimetra realizujte s destilovanou vodou a kyvetou so štandardným roztokom 100 NTU.
2. Do čistej odmernej banky s objemom 200 ml odpipetujte 0,2 ml nízkotučného mlieka a doplňte destilovanou vodou až do objemu 200 ml. Tak si pripravíte prvý roztok nízkotučného mlieka na meranie, kde zrieďovací pomer bude 1:1000, čiže pôvodné mlieko bude 1000-krát zriedené. Rovnako postupujte aj pri príprave ďalších dvoch vzoriek mlieka (polotučného a plnotučného).
3. Keď sú všetky vzorky mlieka pripravené, postupne ich opatrne prelejte do kyviet, ktoré si označte (aby nedošlo k ich zámene). Vkladajte jednotlivé kyvety do turbidimetra a zmerajte turbiditu vzoriek I až III v prostredí SPARKvue.
4. Z nameraných hodnôt turbidity jednotlivých vzoriek mlieka zostrojte kalibračnú závislosť ako vzťah turbidita = funkcia (koncentrácie tuku mlieka), pričom koncentrácia nízkotučného mlieka je 0,5%, polotučného mlieka 1,5% a plnotučného mlieka 3,5%.
5. Stanovte turbiditu neznámej IV. vzorky mlieka (ktorú ste dostali od učiteľa) a z kalibračnej čiary odčítajte, aká by mala byť kvalita neznámej vzorky mlieka. Porovnajte zistenú hodnotu kvality neznámej vzorky mlieka s uvádzanou hodnotou kvality mlieka na obale (z ktorého vám učiteľ dal neznámu vzorku na meranie).
Laboratórne pomôcky a chemikálie:
kadičky s objemom 25 ml (4x); pipeta sklenená s objemom 1 ml (4x); sada plastových kyviet (d = 1); sklená tyčinka; odmerné banky s objemom 200 ml (4x); destilovaná voda a vzorky mlieka (nízkotučné, polotučné a plnotučné)
Inštrumentácia a softvér:
- kolorimeter a turbidimeter PASCO
- PC, notebook, tablet, mobilný telefón
- softvér SPARKvue
- softvér Microsoft Office
Dôležité! Kyvety sa pri meraní turbidity roztokov používajú priehľadné zo všetkých strán. Chytajte ich iba za vrchný uzáver, svetelný lúč musí prechádzať nielen čírou časťou zľava doprava, ako je to naznačené na vrchnej doske prístroja, ale aj zhora nadol. Pred každým meraním je potrebné poriadne utrieť kyvetu papierom a až potom vložiť do turbidimetra.
Návod turbidimeter Pasco
Turbidimeter meria stupeň zákalu (turbidity), keď na časticiach vo vzorke dochádza k rozptylu žiarenia a čiastočne i k jeho absorpcii. Pri meraní sledujeme pokles intenzity žiarenia prechádzajúceho absorbujúcou a rozptyľujúcou vrstvou. Meranie zákalu sa realizuje v priamom smere, v osi svetelného lúča zo zdroja žiarenia.

Bezdrôtový turbidimeter Pasco
Súbor na stiahnutie
Návod turbidimeter PascoMetodika pre učiteľa
Výskumná otázka
Ako zistíme či mlieko ktoré pijeme je kvalitné ?
Teoretický úvod

Obr. 1 e-protokol v Sparkvue

Obr. 2 Teoretický úvod k experimentu
V jednolúčových prístrojoch vkladáme do dráhy svetelného lúča striedavo kyvetu s porovnávacím a meraným roztokom. Na základe porovnania ich rozptylu svetla určíme koncentráciu, alebo riedenie meranej vzorky. Takýmto spôsobom sa eliminujú všetky negatívne vplyvy, ktoré ovplyvňujú rozptyl svetla spôsobený meranou látkou. Porovnávací roztok obsahuje všetky zložky meraného roztoku, okrem meranej látky. Niekedy sa v literatúre označuje ako "blank" alebo "slepý roztok".
Rozširujúce informácie pre učiteľa
Mlieko je veľmi významnou potravinou, na ktorej sme hlavne v rannom detstve mimoriadne závislí. To vyjadruje aj názov cicavce (lat. Mammalia), ktoré sú vývojovo pokročilou triedou stavovcov, ktorá sa v súčasnosti vyskytuje takmer všade na Zemi. V súčasnosti je na celom svete zistený výskyt takmer 5500 druhov cicavcov.
Pojem mlieko je veľmi rozšírený a mnohovýznamový, môže to byť kvapalina produkovaná prsnými žľazami samíc cicavcov na výživu mláďat, kvapalina alebo šťava podobná mlieku cicavcov (napr.: kokosové mlieko, pleťové mlieko, kaučukové mlieko, cementové mlieko, vápenné mlieko, sójové mlieko, ryžové mlieko, mandľové mlieko a iné mlieka). Významovo a prenesene môže znamenať biele sfarbenie, belosť. Tiež sa vyskytuje v nárečových názvoch niektorých rastlín - žabacie mlieko (mlieč močiarny), vtáčié mlieko (lastovičník väčší).
Viac o mlieku pozri na https://sk.wikipedia.org/wiki/Mlieko_(cicavce) .

Obr. 3 Mlieko
Mlieko je veľmi zložitou zmesou látok, z ktorých významnú úlohu pre náš vývoj má mliečna bielkovina – kazeín. Kazeín sa vyskytuje len v mlieku cicavcov. Jeho obsah kolíše medzi 70 – 80 % z celkového počtu bielkovín. V sušine mlieka je ho asi 2,5 – 2,6 %. Je to bielkovina syntetizovaná v sekrečných bunkách mliečnej žľazy. Vytvára zložité útvary - nachádza sa vo forme kazeínových miciel (koloidná fáza – 90 – 95 %) a ako rozpustný ( molekulárna fáza – 5 – 10 %). Micely sú útvary, ktoré vznikajú vo vodnej fáze mlieka ako dôsledok prítomnosti tukových kvapôčok, ktoré sa neznášajú s vodou (sú hydrofóbne, po grécky je hydor voda a fobein znamená báť sa) a nevedia sa v nej rozpustiť na pravý roztok. Micely v mlieku a ich agregáty vnímame ako biele, pretože majú veľkosť väčšiu (rádovo mikrometre, 10-6 metra) ako je vlnová dĺžka červeného svetla (cca 600-700 nm; 0,7 mikrometra) a odrážajú do naších očí všetky fotóny denného svetla (od 400 nm po 750 nm). Pri dostatku Ca prevládajú micely. Ďalším faktorom je teplota. Pod 5 °C (2 – 3 dni) prechádzajú micely na rozpustný kazeín. Nad 70 °C pribúda rozpustný kazeín (vzniká nerozpustný Ca). Pri dlhodobom skladovaní sa uvoľňuje β-kazeín (50 %). Degraduje na γ-kazeín a ten degraduje proteózo–peptónovú frakciu. Veľkosť miciel 80 – 300 nm. Pri ovčom 80 nm. Micely sa skladajú zo submiciel, ktorých je od 300 do 500. Tieto sú pospájané iónmi Ca 2+, Mg 2+, HPO42- ,citrátovými, v malom množstve aj Na+, K+, Mn 2+.
Na povrchu submiciel je nerozpustný Ca3(PO4)2 a tiež zabudovaný ϰ-kazeín. Medzi micelami sa nachádza kapilárna voda. Vodu viažu cukry ϰ – kazeínu a bielkoviny (aminokyseliny COO-). Všetky vlastnosti sa odvíjajú od existencie hydratačného obalu. Micely majú na povrchu hydratačný obal, ktorý je tým väčší, čím má micela väčší náboj. V izoelektrickom bode má vody najmenej a rozpustnosť a stabilita micely je najnižšia. Hydratačný obal sa zmenšuje teplom, sólami (vysoľovanie), dobre rozpustnými látkami vo vode (alkohol), blokovaním polárnych skupín ťažkými kovmi alebo hydrokoloidmi.
Kazeín v čerstvom mlieku sa vyznačuje veľkou termostabilitou, zráža sa pri teplote 150 0C za niekoľko sekúnd a varom po niekoľkých hodinách. Zráža sa syridlom, kyselinami, niektorými soľami (CaCl2, nasýteným roztokom síranu horečnatého alebo amónneho, soľami ťažkých kovov atď.) https://vsetkomlieko.webnode.sk/news/kazein-v-mlieku-zlozenie-mlieka-/.
Pomôcky a materiály
Laboratórne pomôcky a materiály:
- 4x 25 ml kadička
- 4 pipety
- plastové kyviety
- d = 1
- sklená tyčinka
- 3 odmerné valce
- destilovaná voda
- laboratórny plášť
- Mlieko (polotučné, plnotučné, nadojené od chovateľa kráv)
- Jednorázové rukavice

Obr. 4 Laboratórne pomôcky (Beljčka 2019)
Digitálne pomôcky:
- PASCO kolorimeter a turbidimeter
- tablet, iPad
- Softvér Sparkvue
- Softvér Word Microsoft Office 365

Obr. 5 Digitálne pomôcky
Bezpečnosť
Experiment/bádanie je z hľadiska bezpečnosti nenáročný, študenti pracujú s mliekom, s destilovanou vodou.
Príprava techniky na experimentovanie
Pred vyučovacou hodinou učiteľ pripraví:
- Tablety (nabije) a nahrá do nich iPL (e-protokoly).
- Pasco kolorimeter a turbidimeter
- Všetky potrebné laboratórne pomôcky
- Dôkladne si naštuduje prácu v softvéri SPARKvue a s Pasco kolorimetrom a turbidometrom, alebo zadajte aj žiakom si naštudovať hlavne kalibráciu senzora pre meranie turbidity roztokov https://www.youtube.com/watch?v=V_v8gfSCFTU
Dôležité! Kyvety pri meraní turbidity roztokov sa používajú priehľadné zo všetkých strán. Chytajte ich iba za vrchný uzáver, svetelný lúč musí prechádzať čírou časťou zľava doprava ako je to naznačené na vrchnej doske prístroja, ale aj zhora nadol. Pred každým meraním je potrebné poriadne utrieť kyvetu papierom a potom ju vložte do senzora.
Pracovný postup pre prípravu vzoriek na experimentálne meranie
Zapnite wireless senzor kolorimeter a turbidimeter.
Zo zásobníka destilovanej vody odpipetujeme 10 mililitrov (cm3 ) do kadičky alebo liekovnice objemu 25 cm3. Z nej prelejeme vzorku do plastovej kyvety a odmeriame turbiditu. Turbidita destilovanej vody by mala byť 0,0 NTU.
Do ďalšej plastovej kyvety nalejte štandardný roztok s hodnotou turbidity 100 NTU, (ktorý je súčasťou prístroja), odmerajte turbiditu a tým je nakalibrovaný prístroj na správne meranie

Obr. 6 Kalibrácia turbidimetra
Do čistej kadičky odlejeme 10 ml mlieka, prelejeme do kyvety a meriame hodnotu turbidity v plastovej meracej kyvete tak, aby mlieko vyplnilo priestor do výšky minimálne 25 mm, ktorá zabezpečí správne meranie.
Do druhej kadičky odlejeme 10 ml mlieka, zriedime na polovinu (destilovanou vodou), prelejeme do kyvety a meriame hodnotu turbidity v plastovej meracej kyvete tak, aby zriedené mlieko vyplnilo priestor do výšky minimálne 25 mm, ktorá zabezpečí správne meranie.
Do 3 kadičky prelejeme z 2 kadičky 10 ml už zriedeného mlieka a zriedime ho opäť na polovicu a opäť odmeriame turbiditu roztoku mlieka. Tento postup opakujem až dovtedy pokiaľ nedostaneme hodnotu turbidity zriedeného roztoku mlieka približnú, alebo zhodnú s jej hodnotou nameranou pre destilovanú vodu.

Obr. 7 Príprava roztokov mlieka pre meranie ich turbidity
Dôležité je si uvedomiť, že pri nakalibrovaní prístroja pracuje prístroj v oblasti hodnôt 0 až 100 NTU. Preto pri meraní vzoriek riedených na polovicu, štvrtinu, osminu dostávame hodnotu turbidity oveľla vyššie ako je 100 NTU. Tu si musia študenti uvedomiť, že meriame mimo oblasti citlivosti prístroja a teda ak sa chceme dostať do oblasti nakalibrovanej na meranie turbidity vzoriek 0 – 100 NTU, riedenie mlieka destilovanou vodou musí byť oveľa väčšie a to musíme začať 10 ml mlieka zriediť s destilovanou vodou v pomere 1/160, potom ďalšie vzorky z prvej nariedenej vzorky riediť na polovicu a tak postupne nameriame turbidity roztokov v oblasti 0-100 NTU.

Obr. 8 Meranie turbidity 5 zriedených roztokov mlieka, kde len dve posledné vzorky sú v oblasti správneho merania turbidity mlieka
Zostrojte kalibračnú závislosť ako vzťah Turbidita = funkcia (zrieďovací faktor), pričom zrieďovací faktor bude mať hodnotu 1 pre nezriedené mlieko; 0,5 pre mlieko zriedené na polovinu; 0,25 pre pôvodné mlieko zriedené na jednu štvrtinu a tak ďalej.
Zostrojenú kalibračnú závislosť použite na zistenie neznámeho zrieďovacieho faktora vo vzorke mlieka s neznámym riedením.
Aplikujte tento postup na mlieko s rôznym obsahom tukov a diskutujte aká matematická funkcia najlepšie popisuje nameranú závislosť, ako vypočítame výsledok pomocou rovnice funkcie a podobne.
Experiment
Úlohy pre študentov

Obr. 9 e-protokol - úlohy pre študentov
Meranie
Meranie pomocou Pasco kolorimetra a turbidimetra a softvéru Sparkvue

Obr. 10 Meranie turbidity roztokov mlieka v závislosti od ich zrieďovacieho pomeru
Analýza získaných výsledkov
Študenti majú v e-protokole pripravenú stranu kde majú zhodnotiť celý experiment a vyvodiť záver zo svojej bádateľskej práce.
Ukladanie e-Protokolu
Spôsob ako uložiť svoj iProtokol majú študenti k dispozícii na poslednej snímke (obrázok 11)

Obr. 11 Ukladanie protokolov (Brestenská , Beáta; Faďoš, Ivana;, 2019)
Formatívne sebahodnotenie
Nakoniec, majú študenti priestor pre sebahodnotenie (Obrázok ) – kde vyhodnotia, či správne riešili tri zadané úlohy. Formulujú výstižne svoj kognitívny proces, čo im robilo problémy, čo sa naučili, aké zručnosti nadobudli atď.
Diskusia
Odporúčané témy pre ďalšie experimenty:
- Zistite aké sú hodnoty turbidity rôznych druhov mlieka tak že použijete rovnaké zrieďovacie pomery.
- Zistite aká je kvalita vody, ktorú pijeme. Z vodovodu doma, v škole, zo studne, z obchodu a vyvoďte závery.
Študenti, môžu samostatne navrhnúť ďalšie zaujímavé experimenty pre využitie senzora kolorimentra a turbidimetra.
Literatúra
Labuda J., a kolektív: Analytická chémia, ALFA/SNTL, Bratislava 2019.
https://vsetkomlieko.webnode.sk/news/kazein-v-mlieku-zlozenie-mlieka-/